Tapadh leibh airson tadhal air nature.com. Tha taic CSS cuibhrichte aig an dreach brabhsair a tha thu a’ cleachdadh. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh an dreach brabhsair as ùire a chleachdadh (no modh co-chòrdalachd a dhì-chomasachadh ann an Internet Explorer). A bharrachd air sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bidh an làrach seo saor bho stoidhlichean agus JavaScript.
Tha fèithean cnàimhneach na fhigheagan eadar-dhealaichte air a dhèanamh suas sa mhòr-chuid de myofibrils, agus mar as trice bidh iad air an seòrsachadh ann an trì seòrsaichean ann an daoine: aon “slaodach” (seòrsa 1) agus dhà “luath” (seòrsaichean 2A agus 2X). Ach, chan eil tuigse mhath fhathast air an eadar-dhealachadh eadar agus taobh a-staigh seòrsachan myofibril traidiseanta. Chuir sinn dòighean-obrach transcriptomic agus proteomic an sàs ann an 1050 agus 1038 myofibrils fa leth bho vastus lateralis daonna, fa leth. Bha fir anns an sgrùdadh proteomic, agus bha 10 fir agus 2 bhoireannach anns an sgrùdadh transcriptomic. A bharrachd air isoforms slabhraidh throm myosin, chomharraich sinn pròtainean metabolach, pròtainean ribosomal, agus pròtainean ceangail ceallach mar thùsan caochlaideachd eadar-myofibril ioma-thaobhach. A bharrachd air an sin, a dh’ aindeoin comharrachadh cruinneachaidhean de shnàithleanan slaodach is luath, tha an dàta againn a’ moladh nach gabh snàithleanan seòrsa 2X aithneachadh gu fenotipach bho shnàithleanan luath-thwitch eile. A bharrachd air an sin, chan eil seòrsachadh stèidhichte air slabhraidh throm myosin gu leòr airson an fhenotip myofiber a mhìneachadh ann am myopathies nemaline. Gu h-iomlan, tha an dàta againn a’ moladh neo-chunbhalachd ioma-thaobhach myosin, le stòran atharrachaidh a’ leudachadh nas fhaide na isoforms slabhraidh throm myosin.
Tha neo-aonachd cheallach na fheart nàdarrach de gach siostam bith-eòlasach, a’ leigeil le ceallan speisealachadh gus coinneachadh ri feumalachdan eadar-dhealaichte fhigheagan is cheallan.1 Is e am beachd traidiseanta air neo-aonachd snàithleach fèithe cnàimheach gu bheil neurons motair a’ mìneachadh an seòrsa snàithleach taobh a-staigh aonad motair, agus gu bheil an seòrsa snàithleach (ie, seòrsa 1, seòrsa 2A, agus seòrsa 2X ann an daoine) air a dhearbhadh le feartan isoforms slabhraidh throm myosin (MYH).2 Bha seo stèidhichte an toiseach air an neo-sheasmhachd pH ATPase aca,3,4 agus nas fhaide air adhart air an abairt mhóileciuil de MYH.5 Ach, le bhith a’ comharrachadh agus a’ gabhail ris às deidh sin snàithleach “measgaichte” a bhios a’ co-chur an cèill iomadh MYH ann an diofar chuibhreannan, thathas a’ faicinn snàithleach fèithe cnàimheach barrachd is barrachd mar leantainneachd seach mar sheòrsachan snàithleach eadar-dhealaichte.6 A dh’ aindeoin seo, tha an raon fhathast an urra gu mòr ri MYH mar am prìomh sheòrsaiche airson seòrsachadh myofiber, beachd a tha dualtach a bhith air a bhuaireadh le crìochan agus claonaidhean mòra sgrùdaidhean tràth air creimich aig a bheil pròifilean abairt MYH agus raon de sheòrsachan snàithleach eadar-dhealaichte bho na tha ann an daoine.2 Tha an suidheachadh air a dhèanamh nas iom-fhillte leis gu bheil diofar fhèithean cnàimheach daonna a’ taisbeanadh raon eadar-mheasgte de sheòrsachan snàithleach.7 An ’S e fèith measgaichte a th’ ann am vastus lateralis le pròifil abairteachaidh MYH meadhanach (agus mar sin riochdachail).7 A bharrachd air an sin, tha cho furasta ‘s a tha e samplachadh ga dhèanamh mar an fhèith as fheàrr a chaidh a sgrùdadh ann an daoine.
Mar sin, tha rannsachadh neo-chlaon air iomadachd snàithleach fèithe cnàimheach a’ cleachdadh innealan cumhachdach “omics” deatamach ach cuideachd dùbhlanach, gu ìre air sgàth nàdar ioma-niùclasach snàithleach fèithe cnàimheach. Ach, tha teicneòlasan transcriptomics8,9 agus proteomics10 air ar-a-mach a dhèanamh ann an cugallachd anns na bliadhnachan mu dheireadh air sgàth diofar adhartasan teicneòlais, a’ leigeil le mion-sgrùdadh a dhèanamh air fèithean cnàimheach aig rùn aon-shnàithleach. Mar thoradh air an sin, chaidh adhartas mòr a dhèanamh ann a bhith a’ comharrachadh iomadachd aon-shnàithleach agus an fhreagairt do bhrosnachaidhean atrophic agus a bhith a’ fàs nas sine11,12,13,14,15,16,17,18. Gu cudromach, tha tagraidhean clionaigeach aig na h-adhartasan teicneòlais seo, a’ leigeil le comharrachadh nas mionaidiche agus nas mionaidiche de mhì-riaghladh co-cheangailte ri galair. Mar eisimpleir, tha pathophysiology nemaline myopathy, aon de na galairean fèithe oighreachail as cumanta (MIM 605355 agus MIM 161800), iom-fhillte agus troimh-chèile.19,20 Mar sin, dh’ fhaodadh comharrachadh nas fheàrr air mì-riaghladh snàithleach fèithe cnàimheach leantainn gu adhartasan mòra nar tuigse air a’ ghalar seo.
Leasaich sinn dòighean airson mion-sgrùdadh transcriptomic agus proteomic air snàithleanan fèithe cnàimheach singilte a chaidh a sgaradh le làimh bho shamhlaichean bith-eòlasach daonna agus chuir sinn an sàs iad ann am mìltean de shnàithleanan, a’ leigeil leinn sgrùdadh a dhèanamh air neo-chunbhalachd ceallach snàithleanan fèithe cnàimheach daonna. Rè na h-obrach seo, sheall sinn cumhachd fenotapadh transcriptomic agus proteomic de shnàithleanan fèithe agus chomharraich sinn pròtainean ceangail metabolach, ribosomal, agus ceallach mar thùsan cudromach de chaochlaideachd eadar-shnàithleanan. A bharrachd air an sin, a’ cleachdadh an t-sruth-obrach proteomic seo, chomharraich sinn cudromachd clionaigeach myopathy nematode ann an snàithleanan fèithe cnàimheach singilte, a’ nochdadh gluasad co-òrdanaichte a dh’ionnsaigh snàithleanan neo-oxidative neo-eisimeileach bhon t-seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH.
Gus sgrùdadh a dhèanamh air neo-chunbhalachd snàithleanan fèithe cnàimheach daonna, leasaich sinn dà shruth-obrach gus comas a thoirt do sgrùdadh transcriptome agus proteome de shnàithleanan fèithe cnàimheach singilte (Figear 1A agus Figear Taiceil 1A). Leasaich sinn agus leasaich sinn grunn cheumannan modh-obrach, bho stòradh shampall agus gleidheadh ionracas RNA agus pròtain gu bhith ag adhartachadh an toraidh airson gach dòigh-obrach. Airson sgrùdadh transcriptome, chaidh seo a choileanadh le bhith a’ cur còdan-barra moileciuil sònraichte do shampall aig a’ chiad cheum de thar-sgrìobhadh cùil, a’ leigeil le 96 snàithleach a bhith air an cruinneachadh airson giullachd èifeachdach sìos an abhainn. Rinn sreath nas doimhne (± 1 millean leughaidhean gach snàithleach) an taca ri dòighean traidiseanta aon-chealla barrachd beairteis air dàta an transcriptome.21 Airson proteomics, chleachd sinn caisead cromagrafach goirid (21 mionaid) còmhla ri togail dàta DIA-PASEF air speactramadair mais timsTOF gus doimhneachd proteome a bharrachadh fhad ‘s a bha sinn a’ cumail suas toraidh àrd. 22,23 Gus sgrùdadh a dhèanamh air neo-chunbhalachd snàithleanan fèithe cnàimheach fallain, chomharraich sinn tar-sgrìobhaidhean 1,050 snàithlean fa leth bho 14 tabhartaiche inbheach fallain agus proteomes 1,038 snàithlean bho 5 tabhartaichean inbheach fallain (Clàr a bharrachd 1). Anns a’ phàipear seo, canar tar-sgrìobhaidhean agus proteomes 1,000-snàithlean ris na seataichean dàta seo, fa leth. Lorg an dòigh-obrach againn 27,237 tar-sgrìobhaidhean agus 2,983 pròtainean san iomlan anns na mion-sgrùdaidhean tar-sgrìobhaidh agus proteomach 1,000-snàithlean (Figear 1A, Seataichean Dàta a bharrachd 1–2). Às deidh na seataichean dàta tar-sgrìobhaidh agus proteomach a shìoladh airson >1,000 gine a chaidh a lorg agus 50% de luachan dligheach gach snàithlean, chaidh mion-sgrùdaidhean bith-fhiosrachaidh às dèidh sin a dhèanamh airson 925 agus 974 snàithlean anns an tar-sgrìobhaidh agus am proteome, fa leth. Às dèidh sìoladh, chaidh cuibheasachd de 4257 ± 1557 ginean agus 2015 ± 234 pròtainean (mean ± SD) a lorg gach snàithleach, le atharrachadh cuibhrichte eadar daoine fa leth (Figearan a bharrachd 1B–C, Seataichean-dàta a bharrachd 3–4). Ach, bha atharrachadh taobh a-staigh cuspairean nas follaisiche thar chom-pàirtichean, is dòcha air sgàth eadar-dhealachaidhean ann an toradh RNA/pròtain eadar snàithleanan de dhiofar fhaid agus raointean tarsainn-roinneil. Airson a’ mhòr-chuid de phròtainean (>2000), bha an co-èifeachd atharrachaidh fo 20% (Figear a bharrachd 1D). Leig an dà dhòigh le raon farsaing fiùghantach de thar-sgrìobhaidhean agus phròtainean a ghlacadh le soidhnichean air an cur an cèill gu mòr a tha cudromach airson giorrachadh fèithean (me, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figearan a bharrachd 1E–F). Bha a’ mhòr-chuid de na feartan a chaidh a chomharrachadh cumanta eadar na seataichean-dàta tar-sgrìobhaidh agus pròtain (Figear a bharrachd 1G), agus bha dian cuibheasach UMI/LFQ nan feartan sin co-cheangailte gu reusanta math (r = 0.52) (Figear a bharrachd 1H).
Sruth-obrach tar-sgrìobhaidh agus proteomics (air a chruthachadh le BioRender.com). Lùban raon fiùghantach BD airson MYH7, MYH2, agus MYH1, agus stairsnich obraichte a-mach airson sònrachadh seòrsa snàithleach. E, F Sgaoileadh abairt MYH thar snàithleach ann an seataichean dàta tar-sgrìobhaidh agus proteomics. G, H Plotaichean Tuairmse is Ro-mheasadh Iomadachd Èideadh (UMAP) airson tar-sgrìobhaidh agus proteomics air an dath a rèir seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH. I, J Plotaichean feart a’ sealltainn abairt MYH7, MYH2, agus MYH1 ann an seataichean dàta tar-sgrìobhaidh agus proteomics.
An toiseach, chuir sinn romhainn seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH a shònrachadh do gach snàithleach a’ cleachdadh dòigh-obrach leasaichte a bhios a’ gabhail brath air an cugallachd àrd agus an raon fiùghantach de abairt MYH ann an seataichean dàta omics. Tha sgrùdaidhean roimhe air stairsnich neo-riaghailteach a chleachdadh gus snàithleanan a chomharrachadh mar sheòrsa 1 fìor-ghlan, seòrsa 2A, seòrsa 2X, no measgaichte stèidhichte air ceudad stèidhichte de abairt diofar MYHn11,14,24. Chleachd sinn dòigh-obrach eadar-dhealaichte anns an deach abairt gach snàithleach a rangachadh leis na MYHn a chleachd sinn gus na snàithleanan a sheòrsachadh: MYH7, MYH2, agus MYH1, a tha a’ freagairt ri snàithleanan seòrsa 1, seòrsa 2A, agus seòrsa 2X, fa leth. An uairsin rinn sinn àireamhachadh matamataigeach air a’ phuing tionndaidh as ìsle de gach lùb a thig às agus chleachd sinn e mar stairsneach gus snàithleanan a shònrachadh mar dheimhinneach (os cionn na stairsnich) no àicheil (fois na stairsnich) airson gach MYH (Figear 1B–D). Tha an dàta seo a’ sealltainn gu bheil pròifilean abairt on/off nas sònraichte aig MYH7 (Figear 1B) agus MYH2 (Figear 1C) aig ìre an RNA an taca ri ìre a’ phròtain. Gu dearbh, aig ìre a’ phròtain, cha robh mòran snàithleanan ann nach robh a’ cur an cèill MYH7, agus cha robh 100% de chur an cèill MYH2 aig snàithleach sam bith. An uairsin chleachd sinn stairsnich cur an cèill ro-shuidhichte gus seòrsachan snàithlean stèidhichte air MYH a shònrachadh do na snàithleanan uile anns gach seata dàta. Mar eisimpleir, chaidh snàithleanan MYH7+/MYH2-/MYH1- a shònrachadh do sheòrsa 1, agus chaidh snàithleanan MYH7-/MYH2+/MYH1+ a shònrachadh do sheòrsa measgaichte 2A/2X (faic Clàr-taice 2 airson tuairisgeul slàn). Le bhith a’ cruinneachadh nan snàithleanan uile, chunnaic sinn sgaoileadh glè choltach de sheòrsachan snàithlean stèidhichte air MYH aig ìrean RNA (Figear 1E) agus pròtain (Figear 1F), agus bha co-dhèanamh coimeasach nan seòrsachan snàithlean stèidhichte air MYH ag atharrachadh thar dhaoine fa leth, mar a bha dùil (Figear-taice 2A). Chaidh a’ mhòr-chuid de na snàithleanan a sheòrsachadh mar sheòrsa 1 fìor-ghlan (34–35%) no seòrsa 2A (36–38%), ged a chaidh àireamh mhòr de shnàithleanan measgaichte seòrsa 2A/2X a lorg cuideachd (16–19%). Is e eadar-dhealachadh iongantach nach b’ urrainnear snàithleanan seòrsa 2X fìor-ghlan a lorg ach aig ìre an RNA, ach chan ann aig ìre a’ phròtain, a’ moladh gu bheil gnìomhachd luath MYH air a riaghladh gu ìre co-dhiù às dèidh tar-sgrìobhadh.
Dhearbh sinn ar dòigh-obrach seòrsachaidh snàithleach MYH stèidhichte air proteomics le bhith a’ cleachdadh dot blotting stèidhichte air antibodies, agus choilean an dà dhòigh aonta 100% ann a bhith a’ comharrachadh snàithleach fìor-ghlan seòrsa 1 agus seòrsa 2A (faic Figear Taiceil 2B). Ach, bha an dòigh-obrach stèidhichte air proteomics nas mothachaile, nas èifeachdaiche ann a bhith a’ comharrachadh snàithleach measgaichte, agus a’ tomhas co-roinn gach gine MYH anns gach snàithleach. Tha an dàta seo a’ sealltainn cho èifeachdach sa tha e dòigh-obrach oibiaigs, fìor mhothachail, stèidhichte air omics a chleachdadh gus seòrsachan snàithleach fèithe cnàimheach a chomharrachadh.
An uair sin chleachd sinn am fiosrachadh còmhla a thug transcriptomics agus proteomics seachad gus mio-fhiodhan a sheòrsachadh gu reusanta stèidhichte air an transcriptome no proteome iomlan aca. Le bhith a’ cleachdadh an dòigh aonfhoirmeil tuairmseachaidh agus ro-mheasaidh (UMAP) gus an tomhasachd a lughdachadh gu sia prìomh phàirtean (Figearan a bharrachd 3A–B), bha sinn comasach air caochlaideachd mio-fhiodhan fhaicinn anns an transcriptome (Figear 1G) agus proteome (Figear 1H). Gu sònraichte, cha deach mio-fhiodhan a bhuidheachadh a rèir chom-pàirtichean (Figearan a bharrachd 3C–D) no làithean deuchainn (Figear a bharrachd 3E) an dàrna cuid anns na seataichean dàta transcriptomics no proteomics, a’ moladh gu bheil caochlaideachd taobh a-staigh cuspair ann am snàithleanan fèithe cnàimhneach nas àirde na caochlaideachd eadar cuspairean. Anns a’ phlota UMAP, nochd dà chruinneachadh eadar-dhealaichte a’ riochdachadh mio-fhiodhan “luath” agus “slaodach” (Figearan 1G–H). Bha mio-shnàithleanan MYH7+ (slaodach) cruinnichte aig pòla deimhinneach UMAP1, ach bha mio-shnàithleanan MYH2+ agus MYH1+ (luath) cruinnichte aig pòla àicheil UMAP1 (Figearan 1I–J). Ach, cha deach eadar-dhealachadh sam bith a dhèanamh eadar seòrsachan snàithlean luath-thwitch (ie, seòrsa 2A, seòrsa 2X, no measgaichte 2A/2X) stèidhichte air abairt MYH, a’ moladh nach eil abairt MYH1 (Figear 1I–J) no comharran mio-shnàithlean 2X clasaigeach eile leithid ACTN3 no MYLK2 (Figearan a bharrachd 4A–B) a’ dèanamh eadar-dhealachadh eadar diofar sheòrsaichean mio-shnàithlean nuair a thathar a’ beachdachadh air an transcriptome no proteome gu lèir. A bharrachd air an sin, an taca ri MYH2 agus MYH7, bha glè bheag de thranscriptean no phròtainean co-cheangailte gu deimhinneach ri MYH1 (Figearan a bharrachd 4C–H), a’ moladh nach eil pailteas MYH1 a’ nochdadh gu h-iomlan an transcriptome/proteome mio-shnàithlean. Chaidh co-dhùnaidhean coltach ris a ruighinn nuair a chaidh measadh a dhèanamh air an abairt measgaichte de na trì isoforms MYH aig ìre UMAP (Figearan a bharrachd 4I–J). Mar sin, ged a ghabhas snàithleanan 2X aithneachadh aig ìre an tar-sgrìobhaidh stèidhichte air tomhas MYH a-mhàin, chan eil snàithleanan MYH1+ eadar-dhealaichte bho shnàithleanan luath eile nuair a thathar a’ beachdachadh air an tar-sgrìobhaidh no am proteome gu lèir.
Mar sgrùdadh tùsail air neo-chunbhalachd snàithleach slaodach taobh a-muigh MYH, rinn sinn measadh air ceithir pròtainean sònraichte do sheòrsa snàithleach slaodach: TPM3, TNNT1, MYL3, agus ATP2A22. Sheall fo-sheòrsaichean snàithleach slaodach co-dhàimhean Pearson àrd, ged nach robh iad foirfe, le MYH7 an dà chuid ann an transcriptomics (Figear Leasachail 5A) agus proteomics (Figear Leasachail 5B). Cha deach timcheall air 25% agus 33% de shnàithleach slaodach a sheòrsachadh mar shnàithleach slaodach fìor-ghlan leis a h-uile fo-sheòrsa gine/pròtain ann an transcriptomics (Figear Leasachail 5C) agus proteomics (Figear Leasachail 5D), fa leth. Mar sin, bidh seòrsachadh snàithleach slaodach stèidhichte air iomadh fo-sheòrsa gine/pròtain a’ toirt a-steach iom-fhillteachd a bharrachd, eadhon airson pròtainean a tha aithnichte mar a bhith sònraichte do sheòrsa snàithleach. Tha seo a’ moladh nach eil seòrsachadh snàithleach stèidhichte air isoforms de aon teaghlach gine/pròtain a’ nochdadh gu leòr fìor neo-chunbhalachd snàithleach fèithe cnàimheach.
Gus tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air caochlaideachd fenotypic snàithleanan fèithe cnàimheach daonna aig sgèile a’ mhodail omics gu lèir, rinn sinn lùghdachadh neo-chlaon meudachd an dàta a’ cleachdadh mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) (Figear 2A). Coltach ri plotaichean UMAP, cha robh buaidh aig an neach-com-pàirt no an latha deuchainn air cruinneachadh snàithleanan aig ìre PCA (Figearan a bharrachd 6A–C). Anns an dà sheata dàta, chaidh seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH a mhìneachadh le PC2, a sheall cruinneachadh de shnàithleanan seòrsa 1 le gluasad slaodach agus dàrna cruinneachadh anns an robh snàithleanan seòrsa 2A le gluasad luath, seòrsa 2X, agus snàithleanan measgaichte 2A/2X (Figear 2A). Anns an dà sheata dàta, bha an dà chruinneachadh seo ceangailte ri chèile le àireamh bheag de shnàithleanan measgaichte seòrsa 1/2A. Mar a bha dùil, dhearbh mion-sgrùdadh cus-riochdachadh de na prìomh dhraibhearan PC gun robh PC2 air a stiùireadh le soidhnichean cùmhnantail agus metabolach (Figear 2B agus Figearan a bharrachd 6D–E, Seataichean Dàta a bharrachd 5–6). Gu h-iomlan, chaidh a lorg gu robh an seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH gu leòr airson mìneachadh a dhèanamh air atharrachadh leantainneach air feadh PC2, ach a-mhàin na snàithleanan ris an canar 2X a bha sgapte air feadh an transcriptome taobh a-staigh a’ chruinneachaidh luath.
A. Plotaichean mion-sgrùdaidh prìomh phàirtean (PCA) de sheataichean dàta transcriptome agus proteome air an dath a rèir seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH. B. Mion-sgrùdadh beairteachaidh air draibhearan transcript agus pròtain ann am PC2 agus PC1. Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh a’ phacaid clusterProfiler agus luachan-p atharraichte le Benjamini-Hochberg. C, D. Plotaichean PCA air an dath a rèir teirmean ontology gine greamachaidh eadar-cheallach (GO) anns an transcriptome agus teirmean GO costamere anns a’ proteome. Tha saighdean a’ riochdachadh draibhearan transcript agus pròtain agus an stiùiridhean. E, F. Plotaichean feart tuairmseachadh agus ro-mheasadh iomadachd èideadh (UMAP) de fheartan buntainneach gu clinigeach a’ sealltainn ìrean abairteachd neo-eisimeileach bho sheòrsa snàithleach slaodach/luath. G, H. Co-dhàimhean eadar draibhearan PC2 agus PC1 ann an transcriptomes agus proteomes.
Gu h-obann, cha do mhìnich an seòrsa myofiber stèidhichte air MYH ach an dàrna ìre as àirde de chaochlaideachd (PC2), a’ moladh gu bheil pàirt chudromach aig factaran bith-eòlasach eile nach eil co-cheangailte ri seòrsa myofiber stèidhichte air MYH (PC1) ann a bhith a’ riaghladh neo-chunbhalachd snàithleach fèithe cnàimhneach. Nochd mion-sgrùdadh cus-riochdachadh de na prìomh dhraibhearan ann am PC1 gun robh caochlaideachd ann am PC1 air a dhearbhadh sa mhòr-chuid le greamachadh cealla-ri-cealla agus susbaint ribosome anns an transcriptome, agus costameres agus pròtainean ribosomal anns a’ proteome (Figear 2B agus Figearan a bharrachd 6D–E, Seata Dàta a bharrachd 7). Ann am fèithean cnàimhneach, bidh costameres a’ ceangal an diosc-Z ris an sarcolemma agus tha iad an sàs ann an tar-chur feachd agus comharran. 25 Nochd plotaichean PCA le notaichean a’ cleachdadh feartan greamachadh cealla-ri-cealla (transcriptome, Figear 2C) agus costamere (proteome, Figear 2D) gluasad làidir clì ann am PC1, a’ nochdadh gu bheil na feartan sin air an neartachadh ann am snàithleach sònraichte.
Nochd sgrùdadh nas mionaidiche air cruinneachadh myofiber aig ìre UMAP gun robh caisead abairt stèidhichte air MYH neo-eisimeileach bho sheòrsa myofiber aig a’ mhòr-chuid de na feartan seach ìre sònraichte do fho-chruinneachadh myofiber. Chaidh an leantainneachd seo fhaicinn airson grunn ghinean co-cheangailte ri suidheachaidhean pathological (Figear 2E), leithid CHCHD10 (galar neuromuscular), SLIT3 (atrophy fèithe), CTDNEP1 (galar fèithe). Chaidh an leantainneachd seo fhaicinn cuideachd air feadh a’ phròtainome, a’ gabhail a-steach pròtainean co-cheangailte ri eas-òrdughan neurolach (UGDH), comharradh insulin (PHIP), agus tar-sgrìobhadh (HIST1H2AB) (Figear 2F). Còmhla, tha an dàta seo a’ nochdadh leantainneachd ann an neo-chunbhalachd crathadh slaodach/luath neo-eisimeileach bho sheòrsa snàithleach thar diofar myofibers.
Gu inntinneach, sheall ginean draibhear ann am PC2 deagh cho-dhàimh transcriptome-proteome (r = 0.663) (Figear 2G), a’ moladh gu bheil seòrsachan snàithleach slaodach is luath, agus gu sònraichte feartan cùmhnantail is metabolach snàithleach fèithe cnàimheach, air an riaghladh gu tar-sgrìobhaidh. Ach, cha do sheall ginean draibhear ann am PC1 co-dhàimh transcriptome-proteome (r = -0.027) (Figear 2H), a’ moladh gu bheil atharrachaidhean nach eil co-cheangailte ri seòrsachan snàithleach slaodach/luath air an riaghladh sa mhòr-chuid às dèidh tar-sgrìobhaidh. Leis gun deach atharrachaidhean ann am PC1 a mhìneachadh sa mhòr-chuid le teirmean ontology gine ribosomal, agus leis gu bheil ribosomes a’ cluich pàirt chudromach is sònraichte anns a’ chill le bhith a’ gabhail pàirt gu gnìomhach ann an eadar-theangachadh pròtain agus ga thoirt buaidh air,31 chuir sinn romhainn an ath rud sgrùdadh a dhèanamh air an neo-chunbhalachd ribosomal ris nach robh dùil seo.
An toiseach, chuir sinn dath air plota mion-sgrùdaidh prìomh phàirtean a’ phròtain-eòlais a rèir pailteas coimeasach nam pròtainean anns an teirm GOCC “ribosome cytoplasmic” (Figear 3A). Ged a tha an teirm seo air a neartachadh air taobh adhartach PC1, agus mar thoradh air sin tha beagan claonadh ann, bidh pròtainean ribosomal a’ stiùireadh roinneadh anns an dà stiùireadh de PC1 (Figear 3A). Am measg nam pròtainean ribosomal air an neartachadh air taobh àicheil PC1 bha RPL18, RPS18, agus RPS13 (Figear 3B), agus b’ e RPL31, RPL35, agus RPL38 (Figear 3C) na prìomh dhraibhearan air taobh adhartach PC1. Gu inntinneach, bha RPL38 agus RPS13 air an cur an cèill gu mòr ann am fèithean cnàimheach an taca ri clò eile (Figear a bharrachd 7A). Cha deach na comharran ribosomal sònraichte seo ann am PC1 fhaicinn anns an transcriptome (Figear a bharrachd 7B), a’ nochdadh riaghladh iar-transcriptional.
A. Plota mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) air a dhath a rèir teirmean ontology gine ribosomal siotoplasmach (GO) thar a’ phròtainome. Tha saighdean a’ comharrachadh stiùireadh an atharrachaidh a tha air a mheadhanachadh le pròtainean ann am plota PCA. Tha fad na loidhne a’ freagairt ris an sgòr prìomh phàirt airson pròtain sònraichte. B, C. Plotaichean feart PCA airson RPS13 agus RPL38. D. Mion-sgrùdadh cruinneachaidh ìreachail gun stiùireadh de phròtainean ribosomal siotoplasmach. E. Modail structarail den ribosome 80S (PDB: 4V6X) a’ soilleireachadh phròtainean ribosomal le diofar pailteas ann am snàithleanan fèithe cnàimheach. F. Pròtainean ribosomal le stoichiometry eadar-dhealaichte suidhichte faisg air sianal fàgail mRNA.
Chaidh bun-bheachdan neo-aonachd agus speisealachadh ribosomach a mholadh roimhe, far am faod làthaireachd fo-shluaghan ribosomach eadar-dhealaichte (aonachd ribosomach) buaidh dhìreach a thoirt air eadar-theangachadh pròtainean ann an diofar fhigheagan32 agus ceallan33 tro eadar-theangachadh roghnach de phuill tar-sgrìobhaidh mRNA sònraichte34 (speisealachadh ribosomach). Gus fo-shluaghan de phròtainean ribosomach a chomharrachadh a tha air an co-chur an cèill ann an snàithleanan fèithe cnàimheach, rinn sinn mion-sgrùdadh cruinneachaidh ìreachail gun stiùireadh de phròtainean ribosomach anns a’ phròtainome (Figear 3D, Seata Dàta a bharrachd 8). Mar a bha dùil, cha do chruinnich pròtainean ribosomach a rèir seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH. Ach, chomharraich sinn trì cruinneachaidhean eadar-dhealaichte de phròtainean ribosomach; tha a’ chiad chruinneachadh (ribosomal_cluster_1) air a cho-riaghladh le RPL38 agus mar sin tha barrachd abairt ann am snàithleanan le pròifil PC1 adhartach. Tha an dàrna cruinneachadh (ribosomal_cluster_2) air a cho-riaghladh le RPS13 agus tha e àrd ann am snàithleanan le pròifil PC1 àicheil. Chan eil an treas cruinneachadh (ribosomal_cluster_3) a’ sealltainn diofar cho-òrdanaichte ann an abairtean fèithe cnàimheach agus faodar a mheas mar am pròtain ribosomal fèithe cnàimheach “cridhe”. Tha pròtainean ribosomal anns an dà chruinneachadh ribosomal 1 agus 2 a chaidh a shealltainn roimhe seo gus eadar-theangachadh eile a riaghladh (me, RPL10A, RPL38, RPS19, agus RPS25) agus buaidh a thoirt air leasachadh gu gnìomhach (me, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 A rèir thoraidhean PCA, sheall an riochdachadh neo-aonghnèitheach a chaidh fhaicinn de na pròtainean ribosomal seo thar snàithleanan leantainneachd cuideachd (Figear Taiceil 7C).
Gus suidheachadh phròtainean ribosomal neo-aonghnèitheach taobh a-staigh an ribosome a dhèanamh follaiseach, chleachd sinn modail structarail den ribosome 80S daonna (Protein Data Bank: 4V6X) (Figear 3E). Às dèidh dhuinn pròtainean ribosomal a bhuineas do dhiofar chruinneachaidhean ribosomal a sgaradh, cha robh na h-àiteachan aca dlùth-cheangailte, a’ moladh nach do shoirbhich leis an dòigh-obrach againn beairteachadh a thoirt do roinnean/bloighean sònraichte den ribosome. Ach, gu inntinneach, bha an co-roinn de phròtainean fo-aonad mòra ann an cruinneachadh 2 nas ìsle na ann an cruinneachaidhean 1 agus 3 (Figear a bharrachd 7D). Chunnaic sinn gu robh pròtainean le stoichiometry atharraichte ann an snàithleanan fèithe cnàimheach suidhichte sa mhòr-chuid air uachdar an ribosome (Figear 3E), a rèir an comas eadar-obrachadh le eileamaidean làrach inntrigidh ribosome a-staigh (IRES) ann an diofar shluagh mRNA, agus mar sin a’ co-òrdanachadh eadar-theangachadh roghnach. 40, 41 A bharrachd air an sin, bha mòran phròtainean le stoichiometry atharraichte ann an snàithleanan fèithe cnàimheach suidhichte faisg air roinnean gnìomh leithid an tunail fàgail mRNA (Figear 3F), a bhios a’ riaghladh sìneadh eadar-theangachaidh agus grèim peptides sònraichte gu roghnach. 42 Mar gheàrr-chunntas, tha an dàta againn a’ moladh gu bheil stoichiometry phròtainean ribosoma fèithean cnàimheach a’ nochdadh neo-chunbhalachd, agus mar thoradh air sin tha eadar-dhealachaidhean eadar snàithleanan fèithean cnàimheach.
An ath rud, chuir sinn romhainn comharran snàithleach luath is slaodach a chomharrachadh agus sgrùdadh a dhèanamh air na dòighean anns a bheil iad a’ riaghladh tar-sgrìobhaidh. A’ dèanamh coimeas eadar na cruinneachaidhean snàithleach luath is slaodach a mhìnich UMAP anns an dà sheata dàta (Figearan 1G–H agus 4A–B), chomharraich mion-sgrùdaidhean tar-sgrìobhaidh is proteomach 1366 agus 804 feart pailt gu eadar-dhealaichte, fa leth (Figearan 4A–B, Seataichean Dàta a bharrachd 9–12). Chunnaic sinn na h-eadar-dhealachaidhean ris a bheil dùil ann an comharran co-cheangailte ri sarcomeres (me, tropomyosin agus troponin), ceangal brosnachaidh-cùmhnant (isoforms SERCA), agus metabolism lùtha (me, ALDOA agus CKB). A bharrachd air an sin, chaidh tar-sgrìobhaidhean agus pròtainean a bha a’ riaghladh ubiquitination pròtain a chur an cèill gu eadar-dhealaichte ann an snàithleach luath is slaodach (me, USP54, SH3RF2, USP28, agus USP48) (Figearan 4A–B). A bharrachd air sin, chaidh an gine pròtain miocrobach RP11-451G4.2 (DWORF), a chaidh a shealltainn roimhe seo gu bheil e air a chur an cèill ann an diofar dhòighean thar seòrsachan snàithleach fèithe uan43 agus a neartaicheas gnìomhachd SERCA ann am fèithean cridhe44, àrdachadh gu mòr ann am snàithleach fèithe cnàimhneach slaodach (Figear 4A). San aon dòigh, aig ìre nan snàithleach fa leth, chaidh eadar-dhealachaidhean mòra fhaicinn ann an soidhnichean aithnichte leithid isoforms lactate dehydrogenase co-cheangailte ri metabolism (LDHA agus LDHB, Figear 4C agus Figear Leasachail 8A)45,46 a bharrachd air soidhnichean sònraichte seòrsa-snàithleach nach robh aithnichte roimhe (leithid IRX3, USP54, USP28, agus DPYSL3) (Figear 4C). Bha tar-lùbadh mòr ann de fheartan air an cur an cèill ann an diofar dhòighean eadar na seataichean dàta transcriptomic agus proteomic (Figear Leasachail 8B), a bharrachd air co-dhàimh atharrachadh fillte air a stiùireadh sa mhòr-chuid leis an abairt eadar-dhealaichte nas follaisiche de fheartan sarcomere (Figear Leasachail 8C). Gu sònraichte, sheall cuid de na h-ainmean-sgrìobhte (me USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) riaghladh làidir às dèidh tar-sgrìobhaidh aig an ìre proteomic a-mhàin agus bha pròifilean abairteachaidh sònraichte do sheòrsa snàithleach slaodach/luath aca (Figear Taiceil 8C).
Plotaichean bholcàno A agus B a’ dèanamh coimeas eadar cruinneachaidhean slaodach is luath air an comharrachadh leis na plotaichean UMAP agus tuairmse iomadachd èideadh (UMAP) ann am Figearan 1G–H. Tha dotagan dathte a’ riochdachadh tar-sgrìobhaidhean no pròtainean a tha gu math eadar-dhealaichte aig FDR < 0.05, agus tha dotagan nas dorcha a’ riochdachadh tar-sgrìobhaidhean no pròtainean a tha gu math eadar-dhealaichte aig atharrachadh log > 1. Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil dà-shligheach a dhèanamh a’ cleachdadh deuchainn DESeq2 Wald le luachan p atharraichte le Benjamini–Hochberg (transcriptomics) no dòigh modail loidhneach Limma le mion-sgrùdadh Bayesian empirigeach agus an uairsin atharrachadh Benjamini–Hochberg airson ioma-choimeasan (proteomics). C Plotaichean ainm-sgrìobhte de ghinean no phròtainean taghte air an cur an cèill gu eadar-dhealaichte eadar snàithleanan slaodach is luath. D Mion-sgrùdadh beairteachaidh air tar-sgrìobhaidhean agus pròtainean air an cur an cèill gu math eadar-dhealaichte. Tha luachan a tha a’ dol thairis air a chèile air an beairteachadh anns an dà sheata dàta, tha luachan transcriptome air an beairteachadh anns an transcriptome a-mhàin, agus tha luachan proteome air an beairteachadh anns a’ proteome a-mhàin. Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh a’ phacaid clusterProfiler le luachan-p atharraichte le Benjamini-Hochberg. E. Factaran tar-sgrìobhaidh sònraichte do sheòrsa snàithleach air an comharrachadh le SCENIC stèidhichte air sgòran sònraichteachd riaghlaidh a chaidh a thoirt bho SCENIC agus diofar abairtean mRNA eadar seòrsachan snàithleach. F. Pròifileadh de fhactaran tar-sgrìobhaidh taghte air an cur an cèill ann an dòigh eadar-dhealaichte eadar snàithleach slaodach is luath.
An uairsin rinn sinn mion-sgrùdadh cus-riochdachaidh air ginean agus pròtainean a bha air an riochdachadh ann an diofar dhòighean (Figear 4D, Seata Dàta a bharrachd 13). Nochd beairteachadh slighe airson feartan a bha eadar-dhealaichte eadar an dà sheata dàta eadar-dhealachaidhean ris a bheil dùil, leithid pròiseasan β-ocsaididh searbhag geir agus metabolism ketone (snàithleanan slaodach), giorrachadh myofilament/fèithe (snàithleanan luath is slaodach, fa leth), agus pròiseasan catabolach gualaisg (snàithleanan luath). Bha gnìomhachd phosphatase pròtain serine/threonine cuideachd air a mheudachadh ann am snàithleanan luath, air a stiùireadh le feartan leithid na fo-aonadan phosphatase riaghlaidh agus catalaíoch (PPP3CB, PPP1R3D, agus PPP1R3A), a tha aithnichte airson metabolism glycogen a riaghladh (47) (Figearan a bharrachd 8D–E). Am measg shlighean eile a bha beairteach ann am snàithleanan luath bha cuirp giullachd (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) anns a’ phròteome (Figear a bharrachd 8F), a dh’ fhaodadh a bhith an sàs ann an riaghladh iar-sgrìobhaidh (48), agus gnìomhachd factar tar-sgrìobhaidh (SREBF1, RXRG, RORA) anns an transcriptome (Figear a bharrachd 8G). Bha snàithleanan slaodach beairteach ann an gnìomhachd oxidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Figear a bharrachd 8H), ceangal amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figear a bharrachd 8I), maitrís taobh a-muigh cealla (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figear a bharrachd 8J), agus gnìomhachd gabhadair-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Figear a bharrachd 8K).
Gus tuilleadh lèirsinn fhaighinn air an riaghladh tar-sgrìobhaidh a tha na bunait ri feartan seòrsa snàithleach fèithe slaodach/luath, rinn sinn mion-sgrùdadh beairteachaidh factaran tar-sgrìobhaidh a’ cleachdadh SCENIC49 (Seata Dàta Leasachail 14). Bha mòran fhactaran tar-sgrìobhaidh air an neartachadh gu mòr eadar snàithleach fèithe luath is slaodach (Figear 4E). Bha seo a’ toirt a-steach factaran tar-sgrìobhaidh leithid MAFA, a chaidh a cheangal roimhe seo ri leasachadh snàithleach fèithe luath,50 a bharrachd air grunn fhactaran tar-sgrìobhaidh nach robh roimhe seo co-cheangailte ri prògraman gine sònraichte do sheòrsa snàithleach fèithe. Nam measg sin, b’ e PITX1, EGR1, agus MYF6 na factaran tar-sgrìobhaidh as beairtiche ann am snàithleach fèithe luath (Figear 4E). An coimeas ri sin, b’ e ZSCAN30 agus EPAS1 (ris an canar cuideachd HIF2A) na factaran tar-sgrìobhaidh as beairtiche ann am snàithleach fèithe slaodach (Figear 4E). A rèir seo, chaidh MAFA a chuir an cèill aig ìrean nas àirde ann an roinn UMAP a tha a’ freagairt ri snàithleach fèithe luath, agus bha pàtran abairt mu choinneamh aig EPAS1 (Figear 4F).
A bharrachd air ginean aithnichte a bhios a’ còdadh phròtainean, tha grunn bhiotìopan RNA neo-chòdaidh ann a dh’ fhaodadh a bhith an sàs ann an riaghladh leasachadh is galairean daonna. 51, 52 Ann an seataichean dàta transcriptome, tha grunn RNA neo-chòdaidh a’ nochdadh sònrachas seòrsa snàithleach (Figear 5A agus Seata Dàta Leasachail 15), a’ gabhail a-steach LINC01405, a tha gu math sònraichte airson snàithleach slaodach agus a thathar ag aithris gu bheil e air a lùghdachadh ann am fèithean bho euslaintich le myopathy mitochondrial. 53 An coimeas ri sin, tha RP11-255P5.3, a tha a’ freagairt ris a’ ghine lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, a’ nochdadh sònrachas seòrsa snàithleach luath. Tha sònrachas fèithean cnàimheach aig LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) agus RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) le chèile (Figearan Taiceil 9A–B) agus chan eil ginean cùmhnantail aithnichte aca taobh a-staigh an nàbachd genomic 1 Mb aca, a’ moladh gu bheil pàirt shònraichte aca ann a bhith a’ riaghladh seòrsachan snàithleach seach a bhith a’ riaghladh ginean cùmhnantail faisg air làimh. Chaidh na pròifilean abairt slaodach/luath sònraichte do sheòrsa snàithleach de LINC01405 agus RP11-255P5.3, fa leth, a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh RNAscope (Figearan 5B–C).
A. Tha tar-sgrìobhaidhean RNA neo-chòdaidh air an riaghladh gu mòr ann am snàithleanan fèithe slaodach is luath. B. Ìomhaighean riochdachail RNAscope a’ sealltainn sònrachas seòrsa snàithleach slaodach is luath-chrith LINC01405 agus RP11-255P5.3, fa leth. Bàr-sgèile = 50 μm. C. Meudachadh air abairt RNA neo-chòdaidh sònraichte do sheòrsa myofiber mar a chaidh a dhearbhadh le RNAscope (n = 3 biopairean bho dhaoine neo-eisimeileach, a’ dèanamh coimeas eadar snàithleanan fèithe luath is slaodach taobh a-staigh gach neach fa leth). Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh deuchainn-t Oileanach dà-earballach. Tha plotaichean bogsa a’ sealltainn a’ mheadhain agus a’ chiad agus an treas cairteal, le feusagan a’ comharrachadh nan luachan as ìsle agus as àirde. D. Sruth-obrach comharrachaidh pròtain meanbh-bhitheach de novo (air a chruthachadh le BioRender.com). E. Tha am pròtain meanbh-bhitheach LINC01405_ORF408:17441:17358 air a chur an cèill gu sònraichte ann am snàithleanan fèithe cnàimhneach slaodach (n = 5 biopairean bho chom-pàirtichean neo-eisimeileach, a’ dèanamh coimeas eadar snàithleanan fèithe luath is slaodach anns gach com-pàirtiche). Rinneadh mion-sgrùdadh staitistigeil a’ cleachdadh modh modail loidhneach Limm còmhla ri dòigh-obrach eimpireach Bayesian, agus an uair sin modh Benjamini-Hochberg airson coimeasan iomadach le atharrachadh luach-p. Tha plotaichean bogsa a’ sealltainn a’ mheadhain, a’ chiad agus an treas cairteal, le ciorraman a’ comharrachadh nan luachan as àirde/as ìsle.
O chionn ghoirid, tha sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil mòran de na tar-sgrìobhaidhean neo-chòdaidh a tha fo amharas a’ còdachadh phròtainean meanbh-bhitheach tar-sgrìobhte, agus cuid dhiubh sin a’ riaghladh gnìomh fèithean. 44, 55 Gus pròtainean meanbh-bhitheach a chomharrachadh le sònrachas seòrsa snàithleach a dh’fhaodadh a bhith ann, rannsaich sinn an seata dàta proteome 1000 snàithleach againn a’ cleachdadh faidhle FASTA gnàthaichte anns an robh sreathan nan tar-sgrìobhaidhean neo-chòdaidh (n = 305) a lorgar anns an t-seata dàta transcriptome 1000 snàithleach (Figear 5D). Chomharraich sinn 197 pròtainean meanbh-bhitheach bho 22 tar-sgrìobhaidhean eadar-dhealaichte, agus bha 71 dhiubh sin air an riaghladh gu eadar-dhealaichte eadar snàithleanan fèithe cnàimheach slaodach is luath (Figear Taiceil 9C agus Seata Dàta Taiceil 16). Airson LINC01405, chaidh trì toraidhean pròtain meanbh-bhitheach a chomharrachadh, agus sheall aon dhiubh sònrachas snàithleach slaodach coltach ris an tar-sgrìobhadh aige (Figear 5E agus Figear Taiceil 9D). Mar sin, chomharraich sinn LINC01405 mar ghine a tha a’ còdachadh pròtain meanbh-bhitheach sònraichte airson snàithleanan fèithe cnàimheach slaodach.
Leasaich sinn sruth-obrach coileanta airson comharrachadh proteomic mòr-sgèile de shnàithleanan fèithe fa leth agus chomharraich sinn riaghladairean neo-aonachd snàithleanan ann an staidean fallain. Chuir sinn an sruth-obrach seo an sàs gus tuigse fhaighinn air mar a bheir myopathies nemaline buaidh air neo-aonachd snàithleanan fèithe cnàimhneach. Tha myopathies nemaline nan galairean fèithe oighreachail a dh’ adhbhraicheas laigse fèithe agus, ann an clann air a bheil buaidh, a’ nochdadh le raon de dhuilgheadasan a’ gabhail a-steach àmhghar analach, scoliosis, agus gluasaid chuingealaichte buill-bodhaig. 19,20 Mar as trice, ann am myopathies nemaline, bidh atharrachaidhean pathogenic ann an ginean leithid actin alpha 1 (ACTA1) ag adhbhrachadh barrachd co-dhèanamh myofiber snàithleach slaodach-twitch, ged a tha a’ bhuaidh seo neo-aonghnèitheach. Is e aon eisgeachd ainmeil myopathy nemaline troponin T1 (TNNT1), aig a bheil barrachd snàithleanan luath. Mar sin, is dòcha gun cuidich tuigse nas fheàrr air an neo-aonachd a tha aig bonn an dì-riaghladh snàithleanan fèithe cnàimhneach a chithear ann am myopathies nemaline le bhith a’ fuasgladh a’ chàirdeis iom-fhillte eadar na galairean sin agus an seòrsa myofiber.
An coimeas ri smachdan fallain (n=3 gach buidheann), sheall mio-fhiodhan a chaidh a sgaradh bho euslaintich mio-opathy nemaline le mùthaidhean anns na ginean ACTA1 agus TNNT1 crìonadh no dystrophy mio-fhiodha follaiseach (Figear 6A, Clàr-taice 3). Thug seo dùbhlain theicnigeach mòra airson mion-sgrùdadh proteomic air sgàth cho beag ‘s a bha an stuth a bha ri fhaighinn. A dh’ aindeoin seo, b’ urrainn dhuinn 2485 pròtainean a lorg ann an 272 mio-fhiodhan cnàimhneach. Às deidh sìoladh airson co-dhiù 1000 pròtain tomhaiste gach snàithleach, chaidh 250 snàithleach a chur fo mhion-sgrùdadh bith-fhiosrachaidh às deidh sin. Às deidh sìoladh, chaidh cuibheasachd de 1573 ± 359 pròtainean gach snàithleach a thomhas (Figear-taice 10A, Seataichean Dàta a bharrachd 17–18). Gu sònraichte, a dh’ aindeoin an lùghdachadh mòr ann am meud snàithleach, cha deach doimhneachd proteome sampallan euslaintich mio-opathy nemaline a lùghdachadh ach gu ìre bheag. A bharrachd air sin, le bhith a’ giullachd an dàta seo a’ cleachdadh ar faidhlichean FASTA fhèin (a’ gabhail a-steach tar-sgrìobhaidhean neo-chòdaidh) leig sin leinn còig pròtainean meanbh-bhitheach a chomharrachadh ann am mio-shnàithleanan cnàimhneach bho euslaintich mio-chnàimh nemaline (Seata Dàta a bharrachd 19). Bha raon fiùghantach a’ phròtainome gu math nas fharsainge, agus bha na pròtainean iomlan sa bhuidheann smachd co-cheangailte gu math ri toraidhean mion-sgrùdadh pròtainome 1000-snàithleach roimhe (Figear a bharrachd 10B–C).
A. Dealbhan microscopach a’ sealltainn crìonadh no dystrophy snàithleach agus prìomhachd diofar sheòrsaichean snàithleach stèidhichte air MYH ann am myopathies nemaline ACTA1 agus TNNT1 (NM). Bàr sgèile = 100 μm. Gus dèanamh cinnteach à ath-riochdachadh staining ann an euslaintich ACTA1 agus TNNT1, chaidh trì biopsies euslaintich a staining dà no trì thursan (ceithir earrannan gach cùis) mus deach ìomhaighean riochdachail a thaghadh. B. Co-rèirean seòrsa snàithleach ann an com-pàirtichean stèidhichte air MYH. C. Plota mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) de shnàithleach fèithe cnàimhneach ann an euslaintich le myopathies nemaline agus smachdan. D. Snàithleach fèithe cnàimhneach bho euslaintich le myopathies nemaline agus smachdan air am proiseactadh air plota PCA air a dhearbhadh bho na 1000 snàithleach a chaidh a sgrùdadh ann am Figear 2. Mar eisimpleir, plotaichean bholcàno a’ dèanamh coimeas eadar eadar-dhealachaidhean eadar com-pàirtichean le myopathies nemaline ACTA1 agus TNNT1 agus smachdan, agus eadar com-pàirtichean le myopathies nemaline ACTA1 agus TNNT1. Tha cearcallan dathte a’ comharrachadh phròtainean a bha gu math eadar-dhealaichte aig π < 0.05, agus tha dotagan dorcha a’ comharrachadh phròtainean a bha gu math eadar-dhealaichte aig FDR < 0.05. Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh modh modail loidhneach Limma agus dòighean empirigeach Bayesian, agus an uairsin atharrachadh luach-p airson coimeasan ioma-fhillte a’ cleachdadh modh Benjamini-Hochberg. H. Mion-sgrùdadh beairteachaidh air pròtainean a chaidh an cur an cèill gu math eadar-dhealaichte air feadh a’ phròteome gu lèir agus ann an snàithleanan seòrsa 1 agus 2A. Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh a’ cleachdadh am pasgan clusterProfiler agus luachan-p atharraichte le Benjamini-Hochberg. I, J. Plotaichean mion-sgrùdaidh prìomh phàirtean (PCA) air an dath le maitrís taobh a-muigh na cealla agus teirmean ontology gine mitochondrial (GO).
Leis gum faod mio-fhiaclan nemaline buaidh a thoirt air co-roinn nan seòrsaichean mio-fhiaclan a tha a’ cur an cèill MYH ann am fèithean cnàimheach,19,20 rinn sinn sgrùdadh an toiseach air na seòrsaichean mio-fhiaclan a tha a’ cur an cèill MYH ann an euslaintich le mio-fhiaclan nemaline agus smachdan. Cho-dhùin sinn an seòrsa mio-fhiaclan a’ cleachdadh dòigh neo-chlaon a chaidh a mhìneachadh roimhe airson an deuchainn 1000 mio-fhiaclan (Figearan a bharrachd 10D–E) agus a-rithist dh’fhàillig sinn ann a bhith a’ comharrachadh mio-fhiaclan 2X fìor-ghlan (Figear 6B). Chunnaic sinn buaidh eadar-dhealaichte de mio-fhiaclan nemaline air an t-seòrsa mio-fhiaclan, leis gu robh co-roinn nas àirde de mio-fhiaclan seòrsa 1 aig dithis euslaintich le mùthaidhean ACTA1, ach bha co-roinn nas ìsle de mio-fhiaclan seòrsa 1 aig dithis euslaintich le mio-fhiaclan nemaline TNNT1 (Figear 6B). Gu dearbh, chaidh lùghdachadh a dhèanamh air abairteachadh MYH2 agus isoforms troponin luath (TNNC2, TNNI2, agus TNNT3) ann am myopathies ACTA1-nemaline, ach chaidh lùghdachadh a dhèanamh air abairteachadh MYH7 ann am myopathies TNNT1-nemaline (Figear a bharrachd 11A). Tha seo a’ co-chòrdadh ri aithisgean roimhe mu atharrachadh seòrsa myofiber neo-aonghnèitheach ann am myopathies nemaline.19,20 Dhearbh sinn na toraidhean seo le immunohistochemistry agus fhuair sinn a-mach gu robh barrachd myofibers seòrsa 1 aig euslaintich le myopathy ACTA1-nemaline, ach bha am pàtran mu choinneamh aig euslaintich le myopathy TNNT1-nemaline (Figear 6A).
Aig ìre proteome aon-shnàithleach, bha snàithleanan fèithe cnàimheach bho euslaintich myopathy nemaline ACTA1 agus TNNT1 cruinnichte leis a’ mhòr-chuid de shnàithleanan smachd, le snàithleanan myopathy nemaline TNNT1 mar as trice air an tugadh buaidh as miosa (Figear 6C). Bha seo gu sònraichte follaiseach nuair a bha plotaichean mion-sgrùdadh prìomh phàirtean (PCA) de shnàithleanan pseudo-inflated airson gach euslainteach, le euslaintich myopathy nemaline TNNT1 2 agus 3 a’ nochdadh as fhaide air falbh bho shamhlaichean smachd (Figear a bharrachd 11B, Seata Dàta a bharrachd 20). Gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air mar a tha snàithleanan bho euslaintich myopathy an coimeas ri snàithleanan fallain, chleachd sinn fiosrachadh mionaideach a fhuaireadh bho mhion-sgrùdadh proteomic de 1,000 snàithleach bho chom-pàirtichean inbheach fallain. Rinn sinn ro-mheasadh air snàithleanan bhon t-seata dàta myopathy (euslaintich agus smachdan myopathy nemaline ACTA1 agus TNNT1) air a’ phlota PCA a fhuaireadh bhon mhion-sgrùdadh proteomic 1000-snàithleach (Figear 6D). Bha sgaoileadh nan seòrsaichean snàithleach MYH air feadh PC2 ann an snàithleanan smachd coltach ris an sgaoileadh snàithleach a fhuaireadh bhon mhion-sgrùdadh proteomic 1000-snàithleach. Ach, ghluais a’ mhòr-chuid de shnàithleanan ann an euslaintich myopathy nemaline sìos PC2, a’ dol thairis air snàithleanan fallain le teannachadh luath, ge bith dè an seòrsa snàithleach MYH dùthchasach aca. Mar sin, ged a sheall euslaintich le myopathy nemaline ACTA1 gluasad a dh’ionnsaigh snàithleanan seòrsa 1 nuair a chaidh an tomhas a’ cleachdadh dhòighean stèidhichte air MYH, ghluais an dà chuid myopathy nemaline ACTA1 agus myopathy nemaline TNNT1 am proteome snàithleach fèithe cnàimhneach a dh’ionnsaigh snàithleanan le teannachadh luath.
An uairsin rinn sinn coimeas dìreach eadar gach buidheann euslaintich agus smachdan fallain agus chomharraich sinn 256 agus 552 pròtainean le diofar chur an cèill ann am myopathies nemaline ACTA1 agus TNNT1, fa leth (Figear 6E–G agus Figear Taiceil 11C, Seata Dàta Taiceil 21). Nochd mion-sgrùdadh beairteachaidh gine lùghdachadh co-òrdanaichte ann am pròtainean mitochondrial (Figear 6H–I, Seata Dàta Taiceil 22). Gu h-iongantach, a dh’ aindeoin cho mòr-chuid ‘s a bha na seòrsaichean snàithleach ann am myopathies nemaline ACTA1 agus TNNT1, bha an lùghdachadh seo gu tur neo-eisimeileach bhon t-seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH (Figear 6H agus Figearan Taiceil 11D–I, Seata Dàta Taiceil 23). Bha trì pròtainean meanbh-bhitheach cuideachd air an riaghladh ann am myopathies nemaline ACTA1 no TNNT1. Sheall dà de na meanbh-phròtainean seo, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ris an canar cuideachd LINC00598 no Lnc-FOXO1) agus ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), pailteas eadar-dhealaichte ann am mio-shnàithleanan seòrsa 1 a-mhàin. Chaidh aithris roimhe seo gu bheil pàirt aig ENSG00000215483_TR14_ORF67 ann an riaghladh cearcall cealla.56 Air an làimh eile, bha ENSG00000232046_TR1_ORF437 (a tha a’ freagairt ri LINC01798) air a mheudachadh ann am mio-shnàithleanan seòrsa 1 agus seòrsa 2A ann am mio-pathaidh ACTA1-nemaline an taca ri smachdan fallain (Figear a bharrachd 12A, Seata Dàta a bharrachd 24). An coimeas ri sin, cha robh mòran buaidh aig myopathy nemaline air pròtainean ribosoma, ged a chaidh RPS17 a lùghdachadh ann am myopathy nemaline ACTA1 (Figear 6E).
Nochd mion-sgrùdadh beairteachaidh cuideachd àrdachadh ann am pròiseasan an t-siostam dìon ann am myopathies nemaline ACTA1 agus TNNT1, agus chaidh greamachadh cealla a mheudachadh cuideachd ann am myopathy nemaline TNNT1 (Figear 6H). Bha beairteachadh nan factaran taobh a-muigh nan ceallan seo air a nochdadh leis na pròtainean maitrís taobh a-muigh nan ceallan a’ gluasad PCA ann am PC1 agus PC2 ann an taobh àicheil (ie, a dh’ionnsaigh nan snàithleanan as motha a tha fo bhuaidh) (Figear 6J). Sheall an dà bhuidheann euslaintich barrachd abairt de phròtainean taobh a-muigh nan ceallan a tha an sàs ann am freagairtean dìon agus uidheaman càraidh sarcolemmal, leithid annexins (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 agus am pròtain eadar-ghnìomhach S100A1159 (Figearan a bharrachd 12B–C). Chaidh aithris roimhe seo gu bheil am pròiseas seo air a neartachadh ann an dystrophies fèitheach60 ach, cho fad ‘s as aithne dhuinn, cha deach a cheangal roimhe seo ri myopathies nemaline. Tha feum air gnìomhachd àbhaisteach an inneil mhóileciuil seo airson càradh sarcolemmal às deidh dochann agus airson aonadh myocytes a chaidh a chruthachadh às ùr le myofibers58,61. Mar sin, tha an gnìomhachd a tha a’ sìor fhàs sa phròiseas seo anns an dà bhuidheann euslaintich a’ moladh freagairt ath-leasaichte do leòn air adhbhrachadh le neo-sheasmhachd myofibre.
Bha buaidhean gach mio-pathaidh nemaline co-cheangailte gu math (r = 0.736) agus sheall iad for-lùbadh reusanta (Figearan Taiceil 11A–B), a’ nochdadh gu bheil buaidhean coltach ri chèile aig mio-pathaidh nemaline ACTA1 agus TNNT1 air a’ phròtainome. Ach, cha robh cuid de phròtainean air an riaghladh ach ann am mio-pathaidh nemaline ACTA1 no TNNT1 (Figearan Taiceil 11A agus C). B’ e am pròtain profibrotach MFAP4 aon de na pròtainean a chaidh a mheudachadh as motha ann am mio-pathaidh nemaline TNNT1 ach dh’fhan e gun atharrachadh ann am mio-pathaidh nemaline ACTA1. Chaidh SKIC8, pàirt den cho-thàthadh PAF1C a tha an urra ri riaghladh tar-sgrìobhadh gine HOX, a lùghdachadh ann am mio-pathaidh nemaline TNNT1 ach cha robh buaidh aige air ann am mio-pathaidh nemaline ACTA1 (Figear Taiceil 11A). Nochd coimeas dìreach eadar myopathy nemaline ACTA1 agus TNNT1 lùghdachaidhean nas motha ann am pròtainean mitochondrial agus àrdachadh ann am pròtainean an t-siostam dìon ann am myopathy nemaline TNNT1 (Figear 6G–H agus Figearan a bharrachd 11C agus 11H–I). Tha an dàta seo a’ co-chòrdadh ris an atrophy/dystrophy nas motha a chithear ann am myopathy nemaline TNNT1 an taca ri myopathy nemaline TNNT1 (Figear 6A), a’ moladh gu bheil myopathy nemaline TNNT1 a’ riochdachadh cruth nas cruaidhe den ghalar.
Gus measadh a dhèanamh a bheil buaidhean a chaidh fhaicinn de myopathy nemaline a’ leantainn aig ìre na fèithe gu lèir, rinn sinn mion-sgrùdadh proteomic mòr-chuid de biopsies fèithe bhon aon chohort de dh’ euslaintich myopathy nemaline TNNT1 agus rinn sinn coimeas eadar iad agus smachdan (n = 3 gach buidheann) (Figear a bharrachd 13A, Seata Dàta a bharrachd 25). Mar a bha dùil, bha smachdan dlùth-cheangailte ann am mion-sgrùdadh prìomh phàirtean, ach bha caochlaideachd eadar-shampall nas àirde aig euslaintich myopathy nemaline TNNT1 coltach ris an fhear a chithear ann am mion-sgrùdadh snàithleach singilte (Figear a bharrachd 13B). Rinn mion-sgrùdadh mòr ath-riochdachadh air na pròtainean a chaidh an cur an cèill gu eadar-dhealaichte (Figear a bharrachd 13C, Seata Dàta a bharrachd 26) agus pròiseasan bith-eòlasach (Figear a bharrachd 13D, Seata Dàta a bharrachd 27) a chaidh a shoilleireachadh le bhith a’ dèanamh coimeas eadar snàithleanan fa leth, ach chaill sinn a’ chomas eadar-dhealachadh a dhèanamh eadar diofar sheòrsaichean snàithleach agus dh’ fhàillig sinn ann a bhith a’ toirt cunntas air buaidhean galair neo-aonghnèitheach thar snàithleanan.
Còmhla, tha an dàta seo a’ sealltainn gum faod proteomics aon-mio-shnàithleach feartan bith-eòlasach clionaigeach a shoilleireachadh nach gabh an lorg le dòighean cuimsichte leithid immunoblotting. A bharrachd air an sin, tha an dàta seo a’ soilleireachadh cuingealachaidhean a bhith a’ cleachdadh seòrsachadh snàithleach actin (MYH) leis fhèin gus cunntas a thoirt air atharrachadh feno-tìpeach. Gu dearbh, ged a tha atharrachadh seòrsa snàithleach eadar-dhealaichte eadar myopathies nemaline actin agus troponin, bidh an dà myopathies nemaline a’ sgaradh seòrsachadh snàithleach MYH bho metabolism snàithleach fèithe cnàimhneach a dh’ionnsaigh proteome fèithe nas luaithe agus nas lugha oxidative.
Tha neo-aonachd cheallach deatamach airson gum bi figheagan a’ coinneachadh ris na h-iarrtasan eadar-mheasgte aca. Ann am fèithean cnàimheach, thathas tric a’ toirt cunntas air seo mar sheòrsachan snàithleach air an comharrachadh le diofar ìrean de chinneasachadh feachd agus sgìths. Ach, tha e soilleir nach eil seo a’ mìneachadh ach pàirt bheag de atharrachadh snàithleach fèithe cnàimheach, a tha tòrr nas caochlaideach, iom-fhillte agus ioma-thaobhach na bha dùil roimhe. Tha adhartasan teicneòlais a-nis air solas a thilgeil air na factaran a tha a’ riaghladh snàithleach fèithe cnàimheach. Gu dearbh, tha an dàta againn a’ moladh nach eil snàithleach seòrsa 2X nan fo-sheòrsa snàithleach fèithe cnàimheach sònraichte. A bharrachd air an sin, chomharraich sinn pròtainean metabolach, pròtainean ribosomal agus pròtainean co-cheangailte ri ceallan mar phrìomh nithean a tha a’ dearbhadh neo-aonachd snàithleach fèithe cnàimheach. Le bhith a’ cur ar sruth-obrach proteomic an sàs ann an sampallan euslaintich le myopathy nematode, sheall sinn tuilleadh nach eil seòrsachadh snàithleach stèidhichte air MYH a’ nochdadh neo-aonachd fèithean cnàimheach gu h-iomlan, gu sònraichte nuair a tha an siostam air a bhuaireadh. Gu dearbh, ge bith dè an seòrsa snàithleach stèidhichte air MYH, bidh myopathy nematode ag adhbhrachadh gluasad a dh’ionnsaigh snàithleach nas luaithe agus nas lugha oxidative.
Tha snàithleanan fèithe cnàimheach air a bhith air an seòrsachadh bhon 19mh linn. Tha mion-sgrùdaidhean omics o chionn ghoirid air leigeil leinn tòiseachadh a’ tuigsinn phròifilean abairt diofar sheòrsaichean snàithleach MYH agus na freagairtean aca do dhiofar bhrosnachaidhean. Mar a chaidh a mhìneachadh an seo, tha buannachd aig dòighean-obrach omics cuideachd gu bheil iad nas mothachaile airson comharran seòrsa snàithleach a thomhas na dòighean traidiseanta stèidhichte air antibody, gun a bhith an urra ri tomhas aon chomharra (no beagan) gus seòrsa snàithleach fèithe cnàimheach a mhìneachadh. Chleachd sinn sruthan-obrach transcriptomic agus proteomic co-phàirteach agus dh’aonaich sinn na toraidhean gus sgrùdadh a dhèanamh air riaghladh tar-sgrìobhaidh agus iar-tharraingeach neo-aonachd snàithleach ann an snàithleanan fèithe cnàimheach daonna. Mar thoradh air an t-sruth-obrach seo, cha deach snàithleanan fìor-ghlan de sheòrsa 2X a chomharrachadh aig ìre a’ phròtain ann an vastus lateralis ar cohort de fhir òga fallain. Tha seo a rèir sgrùdaidhean snàithleach singilte roimhe a lorg <1% snàithleanan 2X fìor-ghlan ann an vastus lateralis fallain, ged a bu chòir seo a dhearbhadh ann am fèithean eile san àm ri teachd. Tha an eadar-dhealachadh eadar lorg snàithleanan 2X cha mhòr fìor-ghlan aig ìre mRNA agus dìreach snàithleanan 2A / 2X measgaichte aig ìre a’ phròtain na iongnadh. Chan eil abairt mRNA isoform MYH circadian,67 a’ moladh nach eil e coltach gun do “chaill” sinn comharra tòiseachaidh MYH2 ann an snàithleanan 2X a tha coltach ri fìor-ghlan aig ìre RNA. Dh’ fhaodadh aon mhìneachadh a bhith ann, ged a tha e gu tur baraileach, a bhith nan eadar-dhealachaidhean ann an seasmhachd pròtain agus/no mRNA eadar isoforman MYH. Gu dearbh, chan eil snàithlean luath 100% fìor-ghlan airson isoform MYH sam bith, agus chan eil e soilleir an leanadh ìrean abairt mRNA MYH1 anns an raon 70–90% gu pailteas MYH1 agus MYH2 co-ionann aig ìre a’ phròtain. Ach, nuair a thathar a’ beachdachadh air an transcriptome no proteome gu lèir, chan urrainn dha mion-sgrùdadh cruinneachaidh ach dà chruinneachadh eadar-dhealaichte a chomharrachadh a’ riochdachadh snàithleanan fèithe cnàimheach slaodach is luath, ge bith dè an co-dhèanamh MYH mionaideach aca. Tha seo a’ co-chòrdadh ri mion-sgrùdaidhean a’ cleachdadh dhòighean-obrach transcriptomic aon-niùclas, a bhios mar as trice a’ comharrachadh dìreach dà chruinneachadh mio-niùclas eadar-dhealaichte. 68, 69, 70 A bharrachd air sin, ged a tha sgrùdaidhean proteomic roimhe air snàithleanan seòrsa 2X a chomharrachadh, chan eil na snàithleanan sin a’ cruinneachadh air leth bhon chòrr de na snàithleanan luath agus chan eil iad a’ sealltainn ach àireamh bheag de phròtainean a tha pailt ann an diofar dhòighean an taca ri seòrsachan snàithleanan eile stèidhichte air MYH. 14 Tha na toraidhean seo a’ moladh gum bu chòir dhuinn tilleadh chun t-sealladh tràth san 20mh linn air seòrsachadh snàithleanan fèithe, a roinn snàithleanan fèithe cnàimhneach daonna chan ann an trì clasaichean eadar-dhealaichte stèidhichte air MYH, ach ann an dà chruinneachadh stèidhichte air na feartan metabolach agus cùmhnantail aca. 63
Nas cudromaiche buileach, bu chòir beachdachadh air neo-aonachd myofiber thar iomadh tomhas. Tha sgrùdaidhean “omics” roimhe air comharrachadh san t-slighe seo, a’ moladh nach eil snàithleanan fèithe cnàimheach a’ cruthachadh cruinneachaidhean fa leth ach gu bheil iad air an rèiteachadh air feadh leantainneachd. 11, 13, 14, 64, 71 An seo, tha sinn a’ sealltainn, a bharrachd air eadar-dhealachaidhean ann an feartan cùmhnantail agus metabolach fèithe cnàimheach, gum faodar myofibers a dhealachadh le feartan co-cheangailte ri eadar-obrachadh cealla-ri-cealla agus uidheaman eadar-theangachaidh. Gu dearbh, lorg sinn neo-aonachd ribosome ann an snàithleanan fèithe cnàimheach a chuireas ri neo-aonachd neo-eisimeileach bho sheòrsan snàithleach slaodach is luath. Tha adhbhar bunaiteach an neo-aonachd mhòir seo de myofiber, neo-eisimeileach bho sheòrsa snàithleach slaodach is luath, fhathast mì-shoilleir, ach is dòcha gu bheil e a’ comharrachadh eagrachadh fànais sònraichte taobh a-staigh fascicles fèithe a bhios a’ freagairt gu h-iomchaidh ri feachdan agus luchdan sònraichte, 72 conaltradh ceallach no organ sònraichte le seòrsachan cealla eile ann am microàrainneachd fèithe 73,74,75 no eadar-dhealachaidhean ann an gnìomhachd ribosome taobh a-staigh myofibers fa leth. Gu dearbh, chaidh a shealltainn gu bheil ceangal eadar heteroplasmy ribosomach, an dàrna cuid tro ath-chur paralogous de RPL3 agus RPL3L no aig ìre 2′O-methylation de rRNA, agus hypertrophy fèithean cnàimhneach76,77. Cuiridh tagraidhean ioma-omic agus spàsail còmhla ri comharrachadh gnìomhach de myofibres fa leth ri ar tuigse air bith-eòlas fèithean aig an ìre ioma-omic78.
Le bhith a’ dèanamh anailis air pròtainean mio-shnàithleach singilte bho euslaintich le mio-pathaichean nemaline, sheall sinn cuideachd cho feumail, èifeachdach agus iomchaidh ‘s a tha pròtainean mio-shnàithleach singilte gus pathophysiology clionaigeach fèithean cnàimheach a shoilleireachadh. A bharrachd air an sin, le bhith a’ dèanamh coimeas eadar an t-sruth-obrach againn agus mion-sgrùdadh pròtainean cruinneil, b’ urrainn dhuinn a dhearbhadh gu bheil pròtainean mio-shnàithleach singilte a’ toirt a-mach an aon doimhneachd fiosrachaidh ri pròtainean clò cruinneil agus a’ leudachadh an doimhneachd seo le bhith a’ toirt cunntas air neo-aonachd eadar-shnàithleach agus seòrsa mio-shnàithleach. A bharrachd air na h-eadar-dhealachaidhean ris a bheil dùil (ged a tha iad caochlaideach) ann an co-mheas seòrsa snàithleach a chithear ann am mio-pathaichean nemaline ACTA1 agus TNNT1 an taca ri smachdan fallain,19 chunnaic sinn cuideachd ath-dhealbhadh oxidative agus extracellular neo-eisimeileach bho atharrachadh seòrsa snàithleach air a mheadhanachadh le MYH. Chaidh fibrosis aithris roimhe seo ann am mio-fhiadh-chnàimh nemaline TNNT1.19 Ach, tha an anailis againne a’ togail air a’ lorg seo le bhith cuideachd a’ nochdadh ìrean nas àirde de phròtainean co-cheangailte ri cuideam a tha air an dìomhaireachd taobh a-muigh na cealla, leithid annexins, a tha an sàs ann an uidheaman càraidh sarcolemmal, ann am mio-fhiadh-chnàimhean bho euslaintich le mio-fhiadh-chnàimh ACTA1 agus TNNT1.57,58,59 Mar cho-dhùnadh, is dòcha gu bheil ìrean nas àirde ann am mio-fhiadh-chnàimhean bho euslaintich le mio-fhiadh-chnàimh nemaline a’ riochdachadh freagairt ceallach do chàradh mio-fhiadh-chnàimhean a tha gu math atrofach.
Ged a tha an sgrùdadh seo a’ riochdachadh an anailis omics fèithe slàn aon-shnàithleach as motha air daoine gu ruige seo, chan eil e gun chuingealachaidhean. Sgar sinn snàithleanan fèithe cnàimheach bho shampall car beag agus aon-ghnèitheach de chom-pàirtichean agus aon fhèith (an vastus lateralis). Mar sin, chan eil e comasach a bhith a’ cur às do làthaireachd sluagh snàithleach sònraichte thar sheòrsaichean fèithe agus aig fìor chrìochan fiseòlas fèithe. Mar eisimpleir, chan urrainn dhuinn a’ chomas a dhùnadh a-mach gum bi fo-sheata de shnàithleanan ultra-luath (me, snàithleanan 2X fìor-ghlan) a’ nochdadh ann an sprintearan air an trèanadh gu mòr agus / no lùth-chleasaichean neart79 no rè amannan neo-ghnìomhachd fèithe66,80. A bharrachd air an sin, chuir meud cuibhrichte an t-sampall de chom-pàirtichean casg oirnn bho bhith a’ sgrùdadh eadar-dhealachaidhean gnè ann an neo-chunbhalachd snàithleach, leis gu bheil fios gu bheil co-mheasan seòrsa snàithleach eadar-dhealaichte eadar fir is boireannaich. A bharrachd air an sin, cha b’ urrainn dhuinn mion-sgrùdaidhean transcriptomic agus proteomic a dhèanamh air na h-aon shnàithleanan fèithe no sampallan bho na h-aon chom-pàirtichean. Mar a bhios sinne agus feadhainn eile a’ leantainn air adhart a’ leasachadh mion-sgrùdaidhean aon-chealla agus aon-myofibre le bhith a’ cleachdadh mion-sgrùdadh omics gus cuir-a-steach sampall glè ìosal fhaighinn (mar a chithear an seo ann an mion-sgrùdadh snàithleanan bho euslaintich le myopathy mitochondrial), tha an cothrom dòighean-obrach ioma-omics (agus gnìomhach) a chur còmhla taobh a-staigh snàithleanan fèithe singilte a’ tighinn am follais.
Gu h-iomlan, tha an dàta againn a’ comharrachadh agus a’ mìneachadh nan adhbharan tar-sgrìobhaidh agus iar-tharraingeach a tha a’ brosnachadh neo-chunbhalachd fèithean cnàimheach. Gu sònraichte, tha sinn a’ taisbeanadh dàta a tha a’ cur dùbhlan ri dogma a tha air a bhith ann o chionn fhada ann am fiseòlas fèithean cnàimheach co-cheangailte ris a’ mhìneachadh chlasaigeach stèidhichte air MYH air seòrsachan snàithleach. Tha sinn an dòchas an deasbad ùrachadh agus mu dheireadh ath-bheachdachadh a dhèanamh air ar tuigse air seòrsachadh agus neo-chunbhalachd snàithleach fèithean cnàimheach.
Dh’aontaich ceithir com-pàirtichean deug geala (12 fireannaich agus 2 bhoireannach) gu saor-thoileach pàirt a ghabhail san sgrùdadh seo. Chaidh an sgrùdadh aontachadh le Comataidh Beusachd Ospadal Oilthigh Ghent (BC-10237), choilean e Dearbhadh Helsinki 2013, agus chaidh a chlàradh aig ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Tha feartan coitcheann nan com-pàirtichean air an taisbeanadh ann an Clàr-taice 1. Às deidh dhaibh cead fiosraichte beòil is sgrìobhte fhaighinn, chaidh sgrùdadh meidigeach a dhèanamh air com-pàirtichean mus deach an toirt a-steach don sgrùdadh mu dheireadh. Bha com-pàirtichean òg (22–42 bliadhna a dh'aois), fallain (gun tinneasan meidigeach, gun eachdraidh smocadh), agus meadhanach gnìomhach gu corporra. Chaidh an ìre as àirde de ghlacadh ocsaidean a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh ergometer ceum airson fallaineachd chorporra a mheasadh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe. 81
Chaidh sampallan bith-eòlas fèithe a chruinneachadh aig fois agus ann an staid luath trì tursan, 14 latha bho chèile. Leis gun deach na sampallan seo a chruinneachadh mar phàirt de sgrùdadh nas motha, dh'ith com-pàirtichean placebo (lactose), antagonist gabhadair H1 (540 mg fexofenadine), no antagonist gabhadair H2 (40 mg famotidine) 40 mionaid ron bhith-eòlas. Tha sinn air sealltainn roimhe seo nach eil na antagonists gabhadair histamine seo a’ toirt buaidh air fallaineachd fèithean cnàimheach fois81, agus cha deach cruinneachadh co-cheangailte ri staid fhaicinn anns na plotaichean smachd càileachd againn (Figearan Taiceil 3 agus 6). Chaidh daithead àbhaisteach (41.4 kcal/kg cuideam bodhaig, 5.1 g/kg gualaisg cuideam bodhaig, 1.4 g/kg pròtain cuideam bodhaig, agus 1.6 g/kg geir cuideam bodhaig) a chumail suas airson 48 uairean ron gach latha deuchainneach, agus chaidh bracaist àbhaisteach (1.5 g/kg gualaisg cuideam bodhaig) ithe sa mhadainn air latha an deuchainneach. Fo anesthesia ionadail (0.5 ml 1% lidocaine gun epinephrine), fhuaireadh biopsies fèithe bhon fhèith vastus lateralis le bhith a’ cleachdadh tarraing Bergström tron chraiceann.82 Chaidh sampallan fèithe a chuir a-steach sa bhad ann an RNAlater agus an stòradh aig 4°C gus an deach an snàithleach a sgaradh le làimh (suas ri 3 latha).
Chaidh pasganan mio-shnàithleach ùr-sgaraichte a ghluasad gu meadhan RNAlater ùr ann am mias cultar. An uairsin chaidh mio-shnàithleachan fa leth a sgaradh le làimh le bhith a’ cleachdadh stereomicroscop agus clobhaichean mìn. Chaidh còig snàithleach fichead a sgaradh bho gach bith-eòlas, a’ toirt aire shònraichte do bhith a’ taghadh snàithleach bho dhiofar raointean den bhith-eòlas. Às deidh an sgaradh, chaidh gach snàithleach a bhogadh gu socair ann an 3 μl de bhufair lysis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) anns an robh proteinase K agus enzyman DNase gus pròtainean agus DNA nach eilear ag iarraidh a thoirt air falbh. Chaidh lysis cealla agus toirt air falbh pròtain / DNA a thòiseachadh an uairsin le bhith a’ gluasad goirid, a’ snìomh an leaghan ann am microcentrifuge, agus a’ goir aig teòthachd an t-seòmair (10 mionaidean). Chaidh an lysate an uairsin a ghoir ann an rothaichear teirmeach (T100, Bio-Rad) aig 37 ° C airson 5 mionaidean, 75 ° C airson 5 mionaidean, agus an uairsin a stòradh sa bhad aig -80 ° C gus an deach a phròiseasadh tuilleadh.
Chaidh leabharlannan RNA polyadenylated co-chòrdail ri Illumina ullachadh bho 2 µl de lysate myofiber a’ cleachdadh an QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Gheibhear modhan mionaideach ann an leabhar-làimhe an neach-dèanamh. Bidh am pròiseas a’ tòiseachadh le co-chur cDNA a’ chiad shreath le tar-sgrìobhadh cùil, agus rè na h-ùine sin thèid aithnichearan moileciuil sònraichte (UMIs) agus còdan-barra i1 sònraichte don sampall a thoirt a-steach gus dèanamh cinnteach à cruinneachadh shamhlaichean agus gus caochlaideachd theicnigeach a lughdachadh rè giullachd sìos an abhainn. An uairsin thèid cDNA bho 96 myofibers a chruinneachadh agus a ghlanadh le grìogagan magnetach, agus às deidh sin thèid RNA a thoirt air falbh agus thèid co-chur an dàrna sreath a dhèanamh a’ cleachdadh prìomhairean air thuaiream. Tha an leabharlann air a ghlanadh le grìogagan magnetach, thèid tagaichean i5/i7 sònraichte don amar a chur ris, agus thèid PCR a mheudachadh. Bidh ceum glanaidh mu dheireadh a’ toirt a-mach leabharlannan co-chòrdail ri Illumina. Chaidh càileachd gach amar leabharlainn a mheasadh a’ cleachdadh an High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Stèidhichte air tomhas Qubit, chaidh na buileanan a chruinneachadh aig dùmhlachdan co-ionann-mholar (2 nM). Chaidh an cruinneachadh a thig às an sin a shreathachadh air inneal NovaSeq 6000 ann am modh àbhaisteach a’ cleachdadh Pasgan Ath-ghnìomhaiche NovaSeq S2 (1 × 100 niùclasaid) le luchdachadh 2 nM (4% PhiX).
Tha an loidhne-phìoban againn stèidhichte air loidhne-phìoban mion-sgrùdaidh dàta QuantSeq Pool aig Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Chaidh an dàta a dhì-iomadachadh an toiseach le bcl2fastq2 (v2.20.0) stèidhichte air clàr-amais i7/i5. An uairsin chaidh Leughadh 2 a dhì-iomadachadh le idemux (v0.1.6) stèidhichte air còd-barra sampall i1 agus chaidh sreathan UMI a thoirt a-mach le umi_tools (v1.0.1). An uairsin chaidh na leughaidhean a bhearradh le cutadapt (v3.4) ann an grunn chuairtean gus leughaidhean goirid (<20 a dh'fhaid) no leughaidhean anns nach robh ach sreathan adapter a thoirt air falbh. An uairsin chaidh na leughaidhean a cho-thaobhadh ris a’ ghineam daonna a’ cleachdadh STAR (v2.6.0c) agus chaidh faidhlichean BAM a chlàr-amais le SAMtools (v1.11). Chaidh leughaidhean dùblaichte a thoirt air falbh a’ cleachdadh umi_tools (v1.0.1). Mu dheireadh, chaidh cunntadh co-thaobhadh a dhèanamh a’ cleachdadh featureCounts ann an Subread (v2.0.3). Chaidh smachd càileachd a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh FastQC (v0.11.9) aig grunn ìrean eadar-mheadhanach den phìob-loidhne.
Chaidh a h-uile giullachd agus lèirsinn bith-fhiosrachaidh a bharrachd a dhèanamh ann an R (v4.2.3), sa mhòr-chuid a’ cleachdadh sruth-obrach Seurat (v4.4.0). 83 Mar sin, chaidh luachan UMI fa leth agus matrais meata-dhàta atharrachadh gu nithean Seurat. Chaidh ginean a chaidh an cur an cèill ann an nas lugha na 30% de na snàithleanan uile a thoirt air falbh. Chaidh sampallan ìosal-inbhe a thoirt air falbh stèidhichte air stairsneach as ìsle de 1000 luach UMI agus 1000 ginean a chaidh a lorg. Mu dheireadh, chaidh 925 snàithlean seachad air a h-uile ceum sìolaidh smachd càileachd. Chaidh luachan UMI a dhèanamh àbhaisteach a’ cleachdadh dòigh Seurat SCTransform v2, 84 a’ gabhail a-steach na 7418 feartan a chaidh a lorg, agus chaidh eadar-dhealachaidhean eadar com-pàirtichean a thoirt air ais. Gheibhear a h-uile meata-dhàta buntainneach ann an Seata-dàta a bharrachd 28.
Àm puist: 10 Sultain 2025